В одной семье родился первенец. В годик малышу поставили тяжелый диагноз — анемия Фанкони. Это редкое наследственное заболевание, характеризующееся пороками развития, поражением костного мозга, повышенным риском рака. В 3 года 9 месяцев у мальчика нашли медуллобластому. Несмотря на все усилия врачей, не дожив два месяца до пятилетия, ребенок скончался. Ужасное, невыносимое горе для родителей.
Спустя время пара снова решилась на беременность. Чтобы предотвратить повторное рождение больного ребенка, семья согласилась сделать преимплантационное генетическое тестирование на моногенное заболевание (ПГТ-М). Это скрининг эмбрионов в процедуре ЭКО с помощью индивидуальной тест-системы. Но чтобы разработать тест, необходимо знать точные генетические причины недуга.
К анемии Фанкони приводят мутации в двадцати с лишним генах, связанных с репарацией. Наследование — аутосомно-рецессивное. Поэтому предстояло определить патогенные варианты, причем у обоих супругов. Секвенирование полного экзома быстро выявило у мамы мутацию в гене PALB2 (c.172_175del) — это был уже описанный в литературе фреймшифт.
Однако у папы ДНК-диагностика не обнаружила ничего, за что можно было зацепиться. Ни WES, ни MLPA, ни предпринятое ресеквенирование каждого экзона не помогли. Неужели тупик? Ученые сделали ход конем. Они обратили взор на структуру РНК. Разделили транскрипт гена PALB2 на 6 перекрывающихся локусов, провели ПЦР с обратной транскрипцией, профорезили ПЦР-продукты вместе с контрольными образцами. И заметили: участок, покрывающий 10–12 экзоны, укорочен по сравнению с диким типом. Оказалось, что у отца отсутствует 11 экзон. Прочитав ДНК этого локуса методом Сэнгера, ученые обнаружили небольшую делецию в 10 интроне (c.3114-16_3114-11del). Похоже, что именно она приводила к нарушению канонического акцепторного сайта сплайсинга и пропуску экзона (exon skipping). Для верификации эффекта делеции специалисты трансфицировали клетки линии HEK293T плазмидами, экспрессирующими миниген. Функциональный анализ подтвердил: перед нами патогенный вариант.
Титанический труд генетиков и биоинформатиков окупился: удалось создать тест-систему на оба варианта в гене PALB2. Семья успешно прошла ЭКО с ПГТ-М. В лаборатории проверили десять эмбрионов: три оказались компаунд-гетерозиготами, еще пять — несли либо мамину, либо папину мутацию, но нашлись два без генетических дефектов. В результате на свет появилась здоровая девочка!
Спустя время пара снова решилась на беременность. Чтобы предотвратить повторное рождение больного ребенка, семья согласилась сделать преимплантационное генетическое тестирование на моногенное заболевание (ПГТ-М). Это скрининг эмбрионов в процедуре ЭКО с помощью индивидуальной тест-системы. Но чтобы разработать тест, необходимо знать точные генетические причины недуга.
К анемии Фанкони приводят мутации в двадцати с лишним генах, связанных с репарацией. Наследование — аутосомно-рецессивное. Поэтому предстояло определить патогенные варианты, причем у обоих супругов. Секвенирование полного экзома быстро выявило у мамы мутацию в гене PALB2 (c.172_175del) — это был уже описанный в литературе фреймшифт.
Однако у папы ДНК-диагностика не обнаружила ничего, за что можно было зацепиться. Ни WES, ни MLPA, ни предпринятое ресеквенирование каждого экзона не помогли. Неужели тупик? Ученые сделали ход конем. Они обратили взор на структуру РНК. Разделили транскрипт гена PALB2 на 6 перекрывающихся локусов, провели ПЦР с обратной транскрипцией, профорезили ПЦР-продукты вместе с контрольными образцами. И заметили: участок, покрывающий 10–12 экзоны, укорочен по сравнению с диким типом. Оказалось, что у отца отсутствует 11 экзон. Прочитав ДНК этого локуса методом Сэнгера, ученые обнаружили небольшую делецию в 10 интроне (c.3114-16_3114-11del). Похоже, что именно она приводила к нарушению канонического акцепторного сайта сплайсинга и пропуску экзона (exon skipping). Для верификации эффекта делеции специалисты трансфицировали клетки линии HEK293T плазмидами, экспрессирующими миниген. Функциональный анализ подтвердил: перед нами патогенный вариант.
Титанический труд генетиков и биоинформатиков окупился: удалось создать тест-систему на оба варианта в гене PALB2. Семья успешно прошла ЭКО с ПГТ-М. В лаборатории проверили десять эмбрионов: три оказались компаунд-гетерозиготами, еще пять — несли либо мамину, либо папину мутацию, но нашлись два без генетических дефектов. В результате на свет появилась здоровая девочка!
Take-home message. NGS не всесилен, а полагаться на одни алгоритмы нельзя. Интронные варианты, «слепота» программ коллинга, неоднозначности при оценке патогенности запросто спутывают все карты медгенетикам. Только поиск исходя из фенотипа пациента, прокачанная клиническая логика и привлечение дополнительных методов позволяют справляться с кейсами, которые не укладываются в стандартные шаблоны.
